Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией

Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией

ВВЕДЕНИЕ

Определять ферментную метку количественно можно различными методами, например, с помощью колориметрии, флуориметрии, радиометрии и потенциометрии. Недавно для этой цели стали применять также хемилюминесценцию или биолюминесценцию. Ферментные метки, которые можно определять с помощью реакций, сопровождающихся излучением света, представлены в табл. 1. В общем случае чувствительность хеми- и биолюминесцентных методов определения очень высока, а если использовать еще и усиление сигнала от ферментной метки, то чувствительность соответствующих методик иммуноанализа должна быть чрезвычайно высокой. Возможности биолюминесцентного метода недавно были продемонстрированы на примере определения Д-галак-тозидазы. С помощью сопряженной реакции галактозо-дегидроге-наза АОН:РМ№оксидоредуктаза-бактериальная люцифераза удалось обнаружить 2 • 10"²² моля /3-галактозидазы.

В качестве метки в иммуноферментном анализе широко применяют пероксидазу хрена, методы получения и стабилизации конъюгатов с которой хорошо изучены. Пероксидазу хрена чаще всего определяют колориметрически, но для этой цели можно также использовать различные хеми- и биолюминесцентные реакции.

Детально изучено определение пероксидазы с помощью хеми-люминесцентной реакции в системе люминол - пероксид водорода, усиленной фенольными соединениями. Такой подход к определению активности фермента имеет ряд преимуществ в сравнении с другими методами определения; его основные характеристики перечислены в табл. 2.

Усилители. Способностью усиливать излучение света в реакции окисления люминала пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой, обладают различные соединения, в том числе 6-гидроксибензотиазолы, например люциферин, фенолы, нафтолы и амины. На рис. 1 изображены структуры представителей веществ каждого класса. Степень усиления излучения света зависит от концентрации реагентов. Типичная зависимость интенсивности свечения от концентрации усилителя в реакции люмино-ла с пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой и усиливаемой 6-гидрокси-бензотиазолом, представлена на рис. 2.

Синергизм и степень усиления. В системе перокси-даза - люминал - пероксид водорода наблюдается эффект сине-

ргизма, о чем свидетельствуют данные, приведенные в табл. 3. На степень усиления влияют многие факторы; тем не менее достигнуто усиление излучения света более чем в 500 раз. В присутствии некоторых усилителей фоновое излучение света в системе люминол - пероксид водорода уменьшается. При определении активности пероксидазы это позволяет на несколько порядков повысить отношение сигнала к шуму только, за счет применения таких усилителей.

Усиление свечения характерно для различных циклических диацилгидразидов, при действии окислителей в присутствии пероксндазы. Усиление не наблюдается в случае некоторых веществ с пероксидазной активностью, например гемоглобина, который катализирует только колориметрические реакции. Этот факт свидетельствует о более высокой специфичности усиленного хемилюминесцентного анализа по сравнению с колориметрическими методами. Спектры излучаемого света практически одинаковы в усиленных и неусиленных реакциях. Это "говорит о том, что сам по себе усилитель не излучает свет.

В отсутствие усилителей хемилюминесценция в системе пе-роксидаза-люминол-пероксид, по-видимому, лимитируется относительно медленной реакцией пероксндазы, находящейся в форме так называемого соединения II, с люминолом, в результате которой образуются люминольные радикалы и регенерируется пероксидаза. Усилители, способные быстро реагировать с таким соединением, могут увеличивать излучение света, ускоряя превращение соединения II в активную пероксидазу. Продукты превращения усилителя могут затем быстро реагировать с люминолом, образуя дополнительные люминольные радикалы и тем самым способствуя дальнейшему усилению излучения света. Усилители могут воздействовать и на неактивные пероксидазные интермедиа™, например, на соединение III.

Реагенты

Важным фактором в определении пероксидазной активности с помощью усиленной хемилюминесценции является химическая чистота циклических диацилгидразидов. Изучение различных образцов люминола показало, что примеси отрицательно влияют на излучение света. В результате фотохимических и термических процессов люминол частично разлагается, а образующиеся примеси влияют на кинетику и интенсивность излучения света. В табл. 4 представлены результаты сравнения чистоты и свойств некоторых поступающих в продажу препаратов люминола, а также натриевой соли люминола, очищенной перекристаллизацией из раствора гидроксида натрия.

2. УСИЛЕННЫЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Усиленный хемилюминесцентный иммуноанализ с пероксидазой в качестве ферментной метки применяли для определения многих соединений. Ряд примеров приведен в табл. 5. В этих иммуноанализах применяли конкурентные методы и методы с экстракцией иммунного комплекса, а также большинство обычно используемых твердых носителей. На

^а Отношение сигнал/фон при хемилюминесцентном определении пероксидазы хрена с усилением л-иодфенолом; ⁶ ТСХ - тонкослойная хроматография.

рис. 3 представлена схема определения фолликулстимулирующего гормона. В этом методе предел обнаружения FSH на микротитровальном планшете равен около 0,01 м.ед. Метод характеризуется отличной воспроиз