Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Введение

В последние годы в качестве альтернативы радионуклидам в иммуноанализе нашли широкое применение неизотопные метки, в том числе ферменты, хемилюминесцентные соединения, флуорофоры и коллоидные частицы. Применение неизотопных маркеров затрудняется необходимостью синтезировать, очищать и охарактеризовывать белковые конъюгаты в случае каждого определяемого вещества. Ранее система авидин – биотин нашла широкое применение при локализации, обнаружении и очистке белков. Оказалось, что эта система не менее полезна и в иммуноанализе.

В работе детально рассмотрены два подхода, с помощью которых авидин-биотиновая реакция может быть использована в двухцентровом иммуноанализе. В обоих подходах применяли препараты иммобилизованных и биотинилированных антител. Эти препараты отбирали по принципу распознавания различных эпитопов антигена. В первом подходе сначала иммобилизованные антитела вводили в реакцию с исследуемым образцом и биотинилированными антителами. Затем добавляли конъюгат авидина или стрептавидина с ферментом или с хемилюминесцентным маркером. Во втором подходе вместо белкового конъюгата добавляли свободный авидин или стрептавидин и затем добавляли биотинилированный фермент. В обоих случаях определение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции после добавления соответствующих субстратов. В качестве биотинилированных ферментов-маркеров применяли пероксидазу хрена, АВ⁺ -зависимые ферменты, АТР-зависимые ферменты, пенициллиназу и щелочную фосфатазу. Рассмотрим некоторые результаты, полученные с помощью этих двух подходов.

Основные принципы

Уже давно известно, что для обеспечения сильного взаимодействия биотина с гликопротеином яичного белка авидином требуется только уреиднос кольцо витамина. Следовательно, карбоксильную группу остатка валериановой кислоты в биотине можно модифицировать и таким образом получать активные биотинилированные производные. В частности, биотин, связанный с макромолекулой, сохраняет способность связываться с активным центром авидина. Поскольку молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, то с ней могут быть одновременно связаны остатки биотина двух различных биотинилированных белков. Эти свойства авидии-биотинового комплекса широко используются для решения различных задач, в том числе 1) обнаружения, локализации и очистки белков, углеводов и нуклеиновых кислот; 2) разработки методов двухцентрового иммунометрического анализа; 3) картирования эпигонов в гибридомной технологии.

Практическое применение авидин-биотиновой системы ограничивается высокой основностью авидина и наличием в его молекуле углеводных остатков, что в свою очередь обусловливает высокий уровень неспецифического связывания. Более 20 лет назад в бактериях Streptomycesavidiniiбыл обнаружен другой биотинсвязывающий белок, названный стрептавидином. Подобно авидину яичного белка, стрептавидин также образует очень прочный и специфический нековалент-ный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц. Каждая субъединица содержит один биотинсвязываюший центр. В отличие от авидина стрептавидин негликозилирован и имеет нейтральную ph. Авидин и стрептавидин сильно различаются по аминокислотному составу, хотя оба богаты остатками триптофана. Некоторые свойства этих белков приведены в табл. 1.

Таблица 1. Некоторые характеристики авидина и стрептавидина

Стрептавидин можно использовать вместо авидина или в дополнение к нему в авидин-биотиновых системах. Он коммерчески доступен, и, подобно авидину, его можно очищать с помощью аффинной хроматографии на иминобиотиновой колонке. Поскольку бактериальный белок имеет нейтральную изоэлектрическую точку и не содержит углеводных остатков, то для него нехарактерны неспецифические взаимодействия, свойственные авидину яичного белка. Хотя неспецифическое связывание авидина можно свести к минимуму с помощью химических или каких-либо других методов, стрептавиднн и его конъюгаты являются наилучшим решением этой проблемы.

В лаборатории для разработки различных методов иммуноанализа применяются имеющиеся