Термохемилюминесцентный иммуноанализ

Термохемилюминесцентный иммуноанализ

Введение

Люминесценцией называют излучение света в ходе какого-либо процесса. В зависимости от индуцирующего люминесценцию источника энергии ее можно подразделить на физическую люминесценцию и хемилюминесценцию. Физическая люминесценция включает флуоресценцию и фосфоресценцию. В этом случае люминесценция происходит после поглощения световой энергии. Хемилюминесценцией обычно называют излучение света в результате химической реакции. Харви ввел дополнительное ограничение - "при обычной температуре". Позже Селиджер и Макэлрой. Схема реакций представлена на рис. 1.

Люцигенин испускает сине-зеленый свет в присутствии пероксида водорода в щелочной среде. Как показано на рис. 3, многие производные щавелевой кислоты реагируют с Н₂ 0₂ , давая электронно-возбужденное промежуточное соединение, которое далее может вступить в реакцию с присутствующим в реакционной смеси соединением, способным к флуоресценции. В оптимальных условияхэтот процесс является наиболее эффективным из неферментагивных хемилюминесцентных реакций, известных в настоящее время. Эфиры акридиния вступают в высокоэффективные окислительные хемилюминёсцентные реакции с Н₂ 0₂ , давая акридон.

В известной степени эта реакция подобна биолюминесцентной системе люциферин-люцифераза у светляков. Вместе с хемилюминесцентным окислением люминола и близких производных тидразида фталевой кислоты перечисленные реакции широко использовались в хемилюминесцентных аналитических методиках. Во всех указанных реакциях образуется промежуточное соединение одного типа, а именно замещенный четырехчленный 1,2-диоксетан. Диссоциация этого ключевого интермедиа-та приводит к электронно-возбужденным карбонильным соединениям. Следовательно, во всех перечисленных хемилюминесцентных реакциях образуется очень лабильный 1,2-диоксетан, способный диссоциировать, давая люминесцирующее соединение.

За период с 1968 г., когда был синтезирован триметил-1,2-диоксетая, получено более 200 различных хемилюминесцентных 1,2-диоксетанов. Однако эти соединения не привлекли внимания специалистов в области иммуноанализа. Сейчас известно по крайней мере 10 различных методов синтеза 1,2-диоксетанов. Заместителями в этих соединениях могут быть алкильные, арильные, спироалкильные, спироарильные, алкоксильные, арилоксильные, алкиламинные, тиоалкильные и тиоарильные группы. Опубликован ряд обзоров, посвященных 1,2-диоксетанам.

В этих обзорах рассмотрены методы синтеза 1,2-диоксетанов, а также свойства этих соединений. 1,2-Диоксетаны термически распадаются на два карбонильных соединения, одно из которых может быть в первом синглетном или триплетном электронно-возбужденном состоянии. Как показано на рис. 5, возбужденное соединение может испускать свет при переходе в основное состояние или непосредственно, или путем переноса энергии к акцепторной люминесцирующей молекуле А.

Прямая хемилюминесценция 1,2-диоксетанов обычно очень слаба по сравнению с хемилюминесценцией таких соединений, как люминол. Это связано с тем, что большинство кетонов, эфиров и альдегидов, являющихся продуктами диссоциации 1,2-диоксетанов, имеют низкую эффективность флуоресценции.

Энергия активации термического распада большинства 1,2-диоксетанов равна 20-26 ккал/моль. Это означает, что все такие соединения разлагаются в течение нескольких минут или самое большое нескольких недель при комнатной температуре. Поэтому такие соединения не могут выполнять роль хемилюминесцентных меток в аналитических методах invitro. В нашей лаборатории в 1972 г. был синтезирован чрезвычайно стабильный 1,2-диоксетан, а именно адамантилиденадамантан-1,2-диоксетан. Это белое кристаллическое соединение может храниться при комнатной температуре в течение нескольких лет без разложения до адамантанона. Вычисленный период полураспада соединения III при 25°С равен 10⁴ лет. Термическое разложение этого соединения протекает по первому порядку, и скорость хемилюминесцентной реакции не зависит от концентрации 1,2-диоксетана. При повышении температуры период полураспада уменьшается экспоненциально. График такой зависимости для соединения III представлен на рис.

Таким образом, форма кривой хемилюминесценции зависит от температуры. При определенной температурной программе и стандартном периоде измерений наблюдается постоянная кривая хемилюминесценции, не зависящая от концентрации. Поскольку эта хемилюминесценция инициируется и контролируется только температурой и не сопровождается никакими бимолекулярными реакциями, мы можем назвать этот процесс термохемилюминесценцией. Как 1,2-диоксетан, так и продукт распада IV являются бесцветными соединениями, поэтому при Высоких концентрациях самогашение не наблюдается.

Не зависящий от концентрации спектр ТХЛ соединения III представлен на рис. 8. Максимум термохемилюминесценции находится при 425 ям. Спектр напоминает спектр флуоресценции адамантанона.

Получение меток и меченых соединений

Мы синтезировали ТХЛ-метки на основе диадамантил-1,2-диоксетана. Примеры таких соединений представлены на рис. 9. Так как эти 1,2-диоксетаны получали фотоокислением адамантилиденадамантанов с экваториальным заместителем в положении 4, то они образуются в виде смеси сын- и антиизомеров 1,2-диоксетанов. Например, малеинимид V - это сын изомер,

а иодацетат VI - омта-изомер. За исключением иодацетата VI,