Флуоресцентный иммуноанализ с полным внутренним отражением

Флуоресцентный иммуноанализ с полным внутренним отражением

ВВЕДЕНИЕ

Иммуноанализ оказывает большое влияние иа медицинские исследования и клиническую практику с момента его появления в начале шестидесятых годов. Антитела использовали как реагенты для разработки высокочувствительных и специфических методов анализа, которые позволяют определять клинически важные вещества в сложных биологических пробах. Позднее выявились по меньшей мере два главных направления в развитии иммунологических методов анализа. Одно направление с чисто научной основой преследовало цель достижения максимальной теоретически возможной чувствительности. Важнейшим результатом этого иаправления можно считать разработку высокочувствительного иммуноанализа для определения в сыворотке тироидстимулирующего гормона, что в свою очередь впервые позволило дифференцировать больных гипертироидизмом, имеющих очень низкий уровень TSH, и здоровых людей. Для достижения этой цели были опробованы различные методы, которые можно подразделить на несколько групп в соответствий с основными принципами анализа; как правило, в них использовались меченые реагенты. При разработке этих анализов применялись

1)высокоэффективные системы разделения для минимизации уровня фоновых сигналов;

2)новые метки с высокой удельной активностью; 3) приборы с широким рабочим диапазоном, например люминометры или флуо-риметры с временным разрешением.

Эти системы успешно применены для определения уровня TSH в сыворотке, что позволило надежно дифференцировать состояния эутироидизма и гипертироидизма.

Второе общее направление в развитии иммуноанализа касается стадии разделения. Здесь основная цель заключается в создании таких систем анализа, в которых нет необходимости в отделении свободного определяемого вещества от связанного с антителами до измерения сигнала. Наборы для нескольких таких так называемых гомогенных, или безразделительных, методов анализа производятся в промышленном маштабе. Они получили широкое распространение благодаря простоте выполнения анализов и возможности применения в клинической практике. Движущей силой этих разработок были не столько научные интересы, сколько стремление сделать иммуноанализ технически' менее сложным и пригодным для изучения одной или нескольких проб. Другой целью разработки этих наборов является обеспечение возможности выполнения иммуноанализов в децентрализованных пунктах, например в поликлиниках, медпунктах и независимых ~ специализированных больницах. Наличие широкого рынка сбыта стимулировало разработку гомогенных методов анализа. Из них наибольшую известность приобрели системы для анализа в растворах, в которых связывание антител с антигенами приводит к появлению сигнала. Примером может служить метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, впервые предложенный Дандли-кером и др., и соответствующий набор реагентов, выпускаемый в промышленном масштабе фирмой AbbottLaboratories под торговым названием TDx™. Другим примером является методика им-муноферментного анализа типа EMIT™, созданная фирмой SyvaCorporation и основанная на пространственном ингибировании фермента, индуцированном связыванием антителами меченного ферментом антигена.

В других жидкофазных методах используются липосомы, содержащие генератор сигнала. Эти вещества высвобождаются при разрушении оболочки липосом под действием специфического ли-зирующего агента, связанного с антигеном. Лизирующий агент становится относительно неактивным, когда меченый антиген связывается с антителами. Соответствующая аналитическая система разрабатывается фирмой DuPontCorporation. Другой подход предложен фирмой MicrogenicsCorporation, в нем для получения двух неактивных фрагментов уЗ-галактозидазы из E.coliиспользуется технология генной инженерии. Активность фермента восстанавливается при соединении этих фрагментов в растворе. Если один из этих фрагментов связывается с антигеном, то соответствующие антитела будут ингибировать реакцию рекомбинации фрагментов фермента. На основе этого подхода, получившего название CEDIA™, в настоящее время выпускается набор для определения дигоксина в плазме. В целом же все эти жидкофазные гомогенные методы иммуноанализа применяются только для определения гап-тенов, например лекарств или стероидов, что связано в основном с физико-химической природой таких методов анализа. Анализы на основе пространственных эффектов становятся все менее и менее эффективными по мере увеличения размера молекул определяемого вещества. Аналогично в иммуноанализе с поляризацией флуоресценции разность интенсивностей сигналов связанного и свободного антигена, меченного флуорофором, быстро уменьшается с увеличением размера антигена и становится слишком малой, если молекулярная масса антигена достигает 10000 - 20000.

Альтернативный путь для разработки гомогенных методов иммуноанализа был предложен нами и другими исследовательскими группами. Этот подход, который мы первоначально назвали "иммуноанализом на непрерывной поверхности", основан на контроле протекания реакции антиген-антитело после и во время связывания с непрерывной поверхностью, которая является частью системы обнаружения сигнала. Принцип действия этих иммуносенсоров включает иммобилизацию одного из иммунореагейтов на поверхности сенсора, которая изготовлена таким образом, что она приобрела чувствительность к некоторым компонентам или продуктам реакции. Для обнаружения иммунологических реакций на непрерывной поверхности использовались как