Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография

Основы метода

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядом, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.

В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиака, т.е. системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и большую тенденцию ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, дозволяющими регулировать значение рН.

При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступать во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы. Можно провести анализ даже нейтральных молекул сахаров в виде их комплексов с борат-ионом.

Ионообменная хроматография незаменима при разделении вы-сокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким соединениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медицине, биологии, биохимии, для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для разделения неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии проводят за 20–40 мин с лучшим разделением. Применение ионообменной хроматографии в биологии позволило наблюдать за образцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к неправильной интерпретации конечного результата. Интересно использование данного метода для контроля изменений, происходящих с биологическими жидкостями. Применение пористых слабых анионообмеников на силикагелевой основе позволило разделить пептиды. Механизм ионного обмена можно представить в виде следующих уравнений: для анионного обмена

X^- + R⁺ Y^- ↔ Y^- + R⁺ X^- для катионного обмена

X⁺ + R^- Y⁺ ↔ Y⁺ + R^- X⁺

В первом случае ион образца X ^– конкурирует с ионом подвижной фазы Y ^– за ионные центры R⁺ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y⁺ за ионные центры R ^– вступают катионы образца Х⁺ .

Естественно, что ионы образца, слабо взаимодействующие с ионообменником, при этой конкуренции будут слабо удерживаться на колонке и первыми вымываются с нее и, наоборот, более сильно удерживаемые ионы будут элюировать из колонки последними. Обычно возникают вторичные взаимодействия неионной природы за счет адсорбции или водородных связей образца с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно выделить «классическую» ионообменную хроматографию в «чистом» виде, и поэтому некоторые хроматографисты исходят из эмпирических, а не теоретических закономерностей при ионообменной хроматографии.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

Полистирольные ионообменные смолы для ВЭЖХ зернением 10 мкм и менее обладают селективностью и стабильностью, но сетчатая структура их, характеризующаяся расстоянием между узлами сетки 1,5 нм, что значительно меньше размера пор применяемого для адсорбционной хроматографии силикагеля (10 нм), замедляет массообмен и, следовательно, значительно снижает эффективность. Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы представляют собой в основном сополимеры стирола и дивинилбензола. Обычно добавляют 8–12% последнего. Чем больше содержание ди-винилбензола, тем больше жесткость и прочность полимера, выше емкость и, как правило, селективность и тем меньше набухаемость.

Катиониты получают сульфированием матрицы. Протон, ионносвязанный с сульфо-группой, может перемещаться и даже уходить за пределы смолы в раствор. При этом чтобы молекула была в целом электронейтральной, место протона занимает положительно заряженный ион, который из раствора переходит в смолу. Например, при действии Na⁺ Cl ^– на катионо-обменную смолу в Н⁺ -форме происходит реакция обмена:

Смола – SO₄ ^- H⁺ + Na^- → Смола – SO₃ ^-