Реферат на тему:
Возможности ионообменной хроматографии.
Аффинная хроматография
Вместо ступенчатой элюции может оказаться целесообразным постепенно увеличивать концентрацию соли, то есть перейти на элюцию непрерывным градиентом концентрации соли. Линейным или нелинейным - чтобы сократить разрыв между пиками.
В ситуации, изображенной на рис. целесообразно использовать "вогнутый" градиент концентрации соли: медленно нарастающей в области ее малых значений и круто - в области больших концентраций. Это приблизит пик белка 5 к остальным и тем самым сократит время хроматографии.
Я привел для примера способ выбора содержания соли в элюенте в случае уже выбранного рН буфера. Аналогичный опыт можно поставить и для исследования влияния рН при одной определенной концентрации соли. (Напомню, что величина рН обязательно влияет на состояние ионогенных групп белка и, следовательно, на распределение зарядов по поверхности белковой глобулы. В случае использования слабого ионообменника от рН зависит и количество активных ионов на матрице) Далее результаты обоих опытов можно разумно объединить, варьируя (ступенчато или в градиенте) оба параметра. Возможно, что придется сменить ионообменник или существенно удлинить колонку.
Если, несмотря на все усилия, разделить белки смеси в одном хроматографическом опыте не удастся, то можно вышедшие из колонки фракции неразделившихся белков объединить и внести в колонку с другим ионообменником или использовать другой вид хроматографии.
Нередко перед исследователем стоит задача очистки одного определенного белка из смеси с другими. В этом случае оптимальные условия элюции подбирают так, чтобы остальные белки, не разделяясь, отходили от нужного белка в ту или другую сторону, т.е. элюировались раньше него или задерживались на колонке.
Резюмируя, следует заключить, что использование способа фракционирования белков методом ионообменной хроматографии требует весьма серьезной и вдумчивой предварительной работы по оптимизации условий проведения этой хроматографии.
Разумеется, задача еще усложняется, если в распоряжении исследователя нет чистых белков, входящих в состав фракционируемой смеси. В этом случае приходится довольствоваться либо литературными данными об их свойствах, либо вести подбор условий используя по возможности близкие аналоги отсутствующих белков.
На рис. показан результат хроматографического разделения 20-ти белков из 40S - субъединицы рибосомы рачка Artemiasalina (TingShihetal. 1979) Фракционирование вели на колонке СМ-целлюлозы (1х30 см) линейным градиентом NaCI (0-0,4 М) в фосфатном буфере рН6,5.
Разделение отнюдь не блестящее. Методом электрофореза можно добиться заметно лучшего результата. Но зато все белки получены в одном хроматографическом разделении, не ограниченном в отношении препартивного масштаба (можно увеличить количество материала и размер колонки) и нет проблемы элюции белков из геля.
400 300
Рис.
Рис. демонстрирует отмеченные ранее преимущества хро-матографии при среднем давлении в системе FPLC. На анионообменнике "Моно Ф" (см. выше) проводили разделение белков яда Crotalusatrox. Элюцию вели линейным градиентом концентрации NaCI (0-0,35 М) при рН7,5. За 20 минут удалось хорошо разделить более десятка белковых пиков.
В предыдущей главе мы ввели понятия неподвижной и подвижной фаз при хроматографии. Далее было установлено, что для разделения веществ, нанесенных на колонку в виде смеси, необходимо, чтобы для каждого из компонентов этой смеси установилось динамическое равновесие концентраций между двумя фазами.
Эти равновесия должны быть сильно сдвинуты в сторону неподвижной фазы. В ионообменной хроматографии такой сдвиг происходил за счет электростатической, ионной связи каждого из веществ с твердой хроматографической матрицей.
С током подвижной фазы (элюента), уносящей растворенные в ней вещества, все эти равновесия нарушаются и немедленно восстанавливаются (на более низком уровне концентраций) за счет частичного выхода из неподвижной фазы каждого из веществ.
Слоем ниже идет обратный процесс - динамические равновесия устанавливаются за счет перехода веществ из подвижной фазы в неподвижную до тех пор, пока эти новые равновесия не достигнут наивысшего уровня концентраций. После чего снова начинается вымывание веществ элюентом, точно такое же, как происходило в вышележащем слое, который тем временем опустошается.
Так происходит перемещение связанных с матрицей зон различных веществ вниз по колонке. Эти зоны движутся с различными скоростями, что обусловлено различием сил связывания каждой из них с матрицей и, соответственно, различием соотношений равновесных концентраций разделяемых веществ в неподвижной и подвижной зонах.
Повторное изложение сути хроматографического процесса имеет целью обратить внимание читателя на то, что в нем не фигурирует механизм связи веществ с матрицей.
Собственно говоря, не заявлена даже необходимость такой связи, а только условие различия равновесных концентраций в двух зонах, специфическое для каждого из фракционируемых веществ.
Такое условие может быть выполнено и другими способами. Например, можно использовать различие растворимостей этих веществ в разных растворителях. Гидрофильные ве
Наверняка у вас есть товары или услуги, продажа которых приносит вам максимальную прибыль. Для быстрого старта в сети вам необходимо создание посадочной страницы (одностраничного сайта), на которой будет размещена информация о маржинальных товарах/услугах интернет магазина. За 8 лет опыта разработки конверсионных страниц мы выработали оптимальную структуру, которая позволит привлекать через landing page больше продаж. На такую структуру «одевается» ваш контент — фирменный стиль, тексты, фотографии, уникальные торговые предложения, после чего страница выходит в свет. Разработка лендинга и запуск в сети — до 7 рабочих дней. Стоит отметить, что в разработку самой посадочной страницы входит и написание копирайтером продающих текстов для вашего бизнеса, чтобы каждый посетитель страницы захотел совершить покупку именно у вас. Результат: качественно разработаная продающая посадочная страница, которая готова приносить вам новых клиентов.