Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением

Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением

Введение

За последние 25 лет благодарят появлению новых, альтернативных радиоиммуноанализу методов иммуноанализа коренным образом изменились наши представления о возможностях, а также о сфере применения иммуноанализа. Многообразие методик позволило проводить определение бактерий, вирусов, макромолекул и гаптенов, причем в некоторых случаях было достигнуто повышение чувствительности в 10⁶ раз по сравнению с традиционными методами. В большинстве методов иммуноанализа в том или ином варианте используется свет; такие методы можно подразделить на группы в соответствии со способом измерения сигнала - поглощением, отражением, рассеянием или испусканием фотонов.

Основные требования к любой методике иммуноанализа зависят от целей анализа. Так, концентрация определяемого вещества в пробе диктует необходимые чувствительность и диапазон определяемых концентраций. Например, для определения лекарственных препаратов очень высокая чувствительность обычно не нужна, тогда как при определении вирусных и опухолевых антигенов желательна такая чувствительность, какую ни один метод в настоящее время не обеспечивает. Следовательно, при предъявлении требований к конкретной) методике альтернативных методов иммуноанализа необходимо прежде всего детально рассмотреть соответствующую аналитическую задачу.

В этой главе рассматриваются методы иммуноанализа не требующие радиоактивных меток. Очевидно, чтобы оказаться достаточно жизнеспособными, эти новые альтернативные методы иммуноанализа по своим характеристикам не должны уступать иммунорадиометрическому анализу или радиоиммуноанализу. Кроме того, альтернативные методы иммуноанализа должны иметь большие потенциальные возможности для дальнейшего повышения чувствительности, быть простыми, дешевыми, требовать как можно меньше времени для проведения анализа и т.д. При этом альтернативные методы иммуноанализа должны сохранять высокую специфичность и точность.

1. Основные требования к альтернативным методам иммуноанализа

Для минимизации влияния на реакцию антиген-антитело желательно, чтобы метка представляла собой небольшую молекулу. Кроме того, небольшая метка упрощает синтез стабильных конъюгатов, сохраняющих высокую удельную активность. При измерении метки отношение сигнал/шум должно быть максимальным. Сигнал должен быть постоянным, а его измерение - быстрым, хорошо воспроизводимым и осуществимым с помощью доступных приборов. Схема проведения анализа должна предусматривать быструю подготовку и обработку проб. Реагенты должны быть безвредными и легко удаляемыми.

Методика должна:

1) быть применимой как для двухсайтового иммунометрического анализа белков, так и для прямых конкурентных анализов гаптенов, основанных на принципе связывания;

2) иметь соответствующие чувствительность, точность и рабочий диапазон определяемых концентраций с минимальным разбросом результатов во всем диапазоне;

3) легко совершенствоваться с целью дальнейшего повышения чувствительности и упрощения анализа.

Потенциально в методике должна быть заложена возможность ее усовершенствования и применения к анализам других веществ, внелабораторным и безразделительным анализам и к одновременному определению нескольких веществ.

Ранее в литературе уже неоднократно сообщалось об ультрачувствительных иммунометрических методах анализа с ферментным усилением, а также о многочисленных примерах применения фотометрических и нефелометрических методов иммуноанализа. Однако природа меток и характеристики приборов никак не удовлетворяют всем требованиям к иммуноанализу. Идеальным методам иммуноанализа, по всей вероятности, в наибольшей степени соответствуют люминесцентные или фотоэмиссионные методы, в которых детекция метки проводится iio регистрации излучения света.

1.1 Люминесценция

Люминесценция - это эмиссия света веществом, находящимся в электронно-возбужденном состоянии. Существуют несколько типов люминесценции, различающихся только источниками энергии, которая переводит электроны в возбужденное состояние, т.е. на более высокий энергетический уровень, а именно:

Радиалюминесценция, в которой возбуждение соответствующего флуорофора достигается за счет поглощения энергии, выделяющейся в процессе необратимого радиоактивного распада. Возбужденный флуорофор излучает свет, возвращаясь в основное состояние.

Хемилюминесценция, в которой возбуждение достигается в результате химической реакции. Если химическая реакция осуществляется в биологических системах под действием ферментов, то в этом случае обычно употребляют термин биолюминесценция. Если химическая реакция инициируется повышением температуры реагентов, то такой тип люминесценции называют термохемилюминесценцией; если же реакцию инициирует электрический потенциал, то соответствующее явление называют электрохемилюминесценцией.

3) Фотолюминесценция, в которой возбуждение вызывают фотоны инфракрасного, видимого или ультрафиолетового света. Фотолюминесценцию можно далее подразделить на флуоресценцию, когда возбужденная молекула быстро возвращается в исходное состояние через синглетное состояние, и фосфоресценцию, когда возбужденная молекула возвращается в исходное состояние через триплетное состояние. Эмиссия фосфоресценции затухает намного медленнее. Испускаемые кванты света имеют большую длину волны. Фотолюминесценция отличается от радио - и хемилюминесценции тем, что она о